酶活分析是一種常用的生物化學技術(shù)，用于測定酶的活性。酶是一種生物催化劑，能夠加速化學反應(yīng)的速率，而酶活分析則是通過測定酶催化反應(yīng)的速度來評估酶的活性。這種分析方法對于了解生物體內(nèi)的代謝過程、疾病機制以及生物工程等領(lǐng)域具有重要意義。
健康評估
酶活分析可用于評估動植物的健康狀態(tài)，通過檢測特定酶的活性水平，可以及早發(fā)現(xiàn)潛在的健康問題，如肝臟疾病、心血管疾病等。
疾病診斷
某些疾病狀態(tài)會影響體內(nèi)特定酶的活性水平，因此酶活分析可作為輔助診斷工具，幫助醫(yī)生確定疾病類型和進展程度。
營養(yǎng)評估
酶活分析可以反映動植物的營養(yǎng)狀況，一些酶的活性水平受到營養(yǎng)攝入的影響，可以幫助評估動植物的營養(yǎng)攝取情況。
生長發(fā)育
酶活分析可用于評估動植物的生長發(fā)育情況，特定酶的活性水平與生長發(fā)育密切相關(guān)，可以幫助監(jiān)測動植物的生長狀態(tài)。
環(huán)境適應(yīng)
動植物在面對外部環(huán)境變化時，體內(nèi)酶的活性水平也會發(fā)生變化，酶活分析可以幫助評估動植物的環(huán)境適應(yīng)能力。
檢測指標
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指標
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方法
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標準
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樣品
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用量/g
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氧化還原酶（E1）
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乙醇脫氫酶（ADH）EC1.1.1.1
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紫外分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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鮮樣，-20℃及以下保存
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0.5
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谷氨酸脫氫酶（GDH）-還原型NADH-GDH
EC1.4.1.2
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紫外分光光度法
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邱旭華. 水稻氮代謝基礎(chǔ)研究：谷氨酸脫氫酶作用的分子機理
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0.5
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谷氨酸脫氫酶（GDH）-還原型NADPH-GDH
EC1.4.1.2
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紫外分光光度法
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邱旭華. 水稻氮代謝基礎(chǔ)研究：谷氨酸脫氫酶作用的分子機理
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0.5
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谷氨酸脫氫酶（GDH）-氧化型NAD+-GDH
EC1.4.1.2
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紫外分光光度法
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邱旭華. 水稻氮代謝基礎(chǔ)研究：谷氨酸脫氫酶作用的分子機理
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0.5
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谷氨酸脫氫酶（GDH）-還原型NADP+-GDH
EC1.4.1.2
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紫外分光光度法
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邱旭華. 水稻氮代謝基礎(chǔ)研究：谷氨酸脫氫酶作用的分子機理
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0.5
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谷胱甘肽過氧化物酶GPX
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紫外分光光度法
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董衛(wèi)華. Na2SeO3對麥苗谷胱甘肽過氧化物酶影響的研究[D].西南農(nóng)業(yè)大學，2002.
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0.5
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谷胱甘肽還原酶（GR）EC1.6.4.2
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紫外分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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硝酸還原酶（NR）EC1.6.6.1
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鹽酸萘乙二胺比色法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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多酚氧化酶（PPO）EC1.10.3.1
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鄰苯二酚比色法
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廖小軍,徐增慧,智先.熱處理對蘋果果膠甲酯酶和多酚氧化酶活性影響
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0.5
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抗壞血酸過氧化物酶（APX/AsA-POD）EC 1.11.1.1
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分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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過氧化氫酶（CAT）EC1.11.1.6
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紫外吸收法
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王群,劉朝巍,徐文娟.紫外分光光度法測定玉米過氧化氫酶活性新進展
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0.5
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過氧化物酶（POD）EC 1.11.1.7
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愈創(chuàng)木酚比色法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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脂氧合酶（LOX）EC1.13.11.12
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紫外分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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ACC氧化酶（ACO）EC 1.14.17.4
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氣相色譜法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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10
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超氧化物歧化酶（SOD）EC 1.15.1.1
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氮藍四唑光化還原法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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轉(zhuǎn)移酶（E2）
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蔗糖合成酶（SS）EC 2.4.1.13
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間苯二酚比色法
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王鴻飛《果品蔬菜貯藏與加工實驗指導》
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0.5
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蔗糖磷酸合成酶（SPS）EC2.4.1.14
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間苯二酚比色法
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王鴻飛《果品蔬菜貯藏與加工實驗指導》
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0.5
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水解酶（E3）
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果膠甲酯酶/果膠酶/果膠酯酶/果膠氧化酶（PE）EC3.1.1.11
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NaOH滴定法
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王鴻飛《果品蔬菜貯藏與加工實驗指導》
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10
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總淀粉酶（AL）
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DNS比色法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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α淀粉酶（α-AL）EC3.2.1.1
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DNS比色法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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β淀粉酶（β-AL）EC3.2.1.2
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DNS比色法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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纖維素酶（CL）EC3.2.1.4
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DNS比色法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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總幾丁質(zhì)酶（ADH）EC3.2.1.14
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分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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外切幾丁質(zhì)酶
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分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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內(nèi)切幾丁質(zhì)酶
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分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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多聚半乳糖醛酸酶（PG）EC 3.2.1.15
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DNS比色法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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β-葡萄糖苷酶（β-GC）EC3.2.1.21
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DNS比色法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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β-半乳糖苷酶（β-GAL）EC 3.2.1.23
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紫外分光光度法
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董黎梨,汪永保,李映志等.菠蘿蜜果實糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性變化
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0.5
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中性轉(zhuǎn)化酶（NI）
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DNS比色法
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王永章,王小芳,張大鵬.蘋果果實轉(zhuǎn)化酶的種類和特性研究
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0.5
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酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）EC 3.2.1.26
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DNS比色法
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王永章,王小芳,張大鵬.蘋果果實轉(zhuǎn)化酶的種類和特性研究
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0.5
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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）EC3.2.1.55
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紫外分光光度法
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莊軍平,蘇菁,李雪萍,陳維信.香蕉果實成熟軟化時果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的變化
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0.5
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β-1，3-葡聚糖酶（β-1,3-GA）EC3.2.1.73
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DNS比色法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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裂解酶（E4）
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丙酮酸脫羧酶（PDC）EC4.1.1.1
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紫外分光光度法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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0.5
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果膠裂解酶（PL）EC4.2.2.10
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紫外分光光度法
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高秋芳,郭安平,孔華,鄧偉科,賀立卡.果膠裂解酶、木聚糖酶及果膠裂解酶、木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達
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0.5
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苯丙氨酸解氨酶（PAL）EC4.3.1.5
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紫外分光光度法
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王學奎《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》
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0.5
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ACC合成酶（ACS）EC 4.4.1.14
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氣相色譜法
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曹建康《果蔬采后生理生化實驗指導》
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10
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連接酶（E6）
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谷氨酰胺合成酶（GS）EC 6.3.1.2
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分光光度法
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陳勝勇,侯靜,李彩鳳,馬鳳鳴,尹春佳,黃兆峰.蛋白和核酸合成抑制劑對氮素誘導甜菜谷氨酰胺合成酶基因表達的影響
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0.5
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檢測方法
紫外分光光度法
紫外分光光度法是一種常用的分析方法，它基于分子吸收特定波長的光后發(fā)生能級躍遷的原理。在酶活性分析中，這種方法通常涉及到酶催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生具有特定吸收光譜的產(chǎn)物。通過測量反應(yīng)前后溶液的光密度變化，可以計算出產(chǎn)物的濃度，進而計算酶的活性。
分光光度法
分光光度法是一種常用的測定酶活性的方法，它具有靈敏度高、操作簡便、重復性好等優(yōu)點。基本原理是，在特定的條件下，酶可以催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生一種叫做產(chǎn)物的物質(zhì)。這個產(chǎn)物通常具有特定的吸收光譜，因此可以通過測量反應(yīng)前后溶液的光密度變化來計算產(chǎn)物的濃度，進而計算酶的活性。
DNS比色法
全稱為3,5-二硝基水楊酸比色法，是一種常用于測定還原糖含量的化學分析方法。該方法的基本原理是在堿性條件下，二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系。因此，通過比色法可以間接測定酶解后還原產(chǎn)物的生成量，以表示酶的活力。
樣本采集
血液樣本采集
動物：可以從動物的靜脈或尾靜脈采集血液樣本。使用無添加抗凝劑的干凈采血管，避免血液凝固。動物應(yīng)處于空腹狀態(tài)，以減少飲食引起的酶活性波動。采集后立即將樣本置于冰上，盡快分離血漿或血清，并在-20℃至-80℃下儲存。
植物：對于植物，可以采集植物的葉片或莖部分，進行樣本處理后提取植物汁液作為血液樣本。選擇在早晨或傍晚，此時酶活性較為穩(wěn)定。使用鋒利的剪刀或手術(shù)刀，快速切割以減少組織損傷。立即將樣本放入預冷的容器中，使用冰袋或干冰保持低溫，隨后在液氮中冷凍并儲存在-80℃冰箱中。
組織樣本采集
動物：從動物的肝臟、肌肉、腎臟等組織中采集樣本。確保采集過程無污染，避免外源物質(zhì)的干擾。在動物死亡后立即采集，以避免死后酶活性的變化。將組織樣本迅速置于液氮中冷凍，然后儲存在-80℃冰箱中，以保持酶的活性。
植物：可以從植物的根部、莖部、葉片等組織中采集樣本，保持樣本的新鮮性和完整性。選擇在早晨或傍晚，此時酶活性較為穩(wěn)定。使用鋒利的剪刀或手術(shù)刀，快速切割以減少組織損傷。立即將樣本放入預冷的容器中，使用冰袋或干冰保持低溫，隨后在液氮中冷凍并儲存在-80℃冰箱中。
細胞樣本采集
可以通過細胞培養(yǎng)或細胞分離技術(shù)，從動植物的組織或血液中分離出單個細胞，用于酶活檢測。
共同注意事項
·樣本量：確保采集的樣本量足夠進行多次實驗，以提高數(shù)據(jù)的可靠性。
·無菌操作：整個采集過程應(yīng)采用無菌技術(shù)，避免微生物污染，特別是對于需要在體外進行酶活檢測的樣本。
·快速處理：樣本采集后應(yīng)盡快進行處理，避免酶活性的自然衰減，特別是在室溫下暴露時間應(yīng)盡可能短。
·詳細記錄：記錄樣本采集的時間、地點、條件等信息，以及任何可能影響酶活性的因素，如樣本的處理方式和儲存條件。
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樣本要求
采集的樣品，均應(yīng)在短時間內(nèi)進行分析檢測，如不能及時分析檢測的則需要進行處理和保存，一般應(yīng)遵循的原則是：環(huán)境干燥、溫度較低、避免光照、密封保存。
鮮樣：取樣后立即放入用于包裝樣本的鋁箔或冷凍保存管（提前進行編號）并放入液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存，足量干冰郵寄運輸，避免反復凍融。
烘干樣：取樣后用柔軟濕布擦凈，不應(yīng)用水沖洗。盡快晾干并將樣品置于105?℃的烘箱中烘 15min以終止樣品中酶的活動。經(jīng)過殺青之后，應(yīng)立即降低烘箱的溫度，維持在70 ～80℃，直到烘至恒重。若測定樣品中金屬元素的含量，應(yīng)注意金屬器械的污染問題，以防干擾。
樣品前處理
組織樣品前處理
動物：對于動物組織樣品，首先需要將組織樣品進行研磨或切割，以釋放細胞內(nèi)的酶。可以使用離心等方法將細胞壁破碎，釋放酶。
植物：對于植物組織樣品，需要將植物組織研磨或切割，并使用適當?shù)奶崛∫禾崛≈参锛毎麅?nèi)的酶。
血液樣品前處理
動物：對于血液樣品，可以通過離心或沉淀的方式將血細胞分離出來，獲取血清或血漿樣品。血清或血漿樣品中含有豐富的酶，在適當條件下可以測定其活性。
植物：對于植物血液樣品，可以將植物汁液離心或沉淀，獲取含有酶的上清液進行后續(xù)的酶活檢測。
細胞樣品前處理
對于細胞樣品，需要對細胞進行裂解處理，釋放細胞內(nèi)的酶?？梢允褂眉毎呀庖夯虺暡ǖ确椒ㄟM行細胞破碎，并獲取含有酶的提取液。
酶提取
·使用合適的緩沖液提取酶，緩沖液的選擇應(yīng)考慮酶的最適pH和穩(wěn)定性，常見的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。
·添加蛋白酶抑制劑（如PMSF、抑肽酶等）以防止酶被其他蛋白酶降解。
·根據(jù)酶的性質(zhì)，可能需要在低溫下進行提取，以減少酶的失活。
樣品澄清
使用離心（通常是10,000-15,000 rpm，10-30分鐘）或過濾去除細胞碎片和其他不溶性物質(zhì)，以得到澄清的酶提取液。
蛋白質(zhì)濃度測定
測定酶提取液中的總蛋白質(zhì)濃度，常用的測定方法包括BCA法、Bradford法等，這對于標準化酶活性測定至關(guān)重要。
酶活性測定
·根據(jù)目標酶的特性，選擇合適的底物和檢測方法。常見的酶活性測定方法包括分光光度法、熒光法、放射性同位素法等。
·控制反應(yīng)條件，如溫度、pH、反應(yīng)時間等，確保酶活性測定的準確性和重復性。
樣品儲存
·如果不能立即進行酶活性測定，酶提取液應(yīng)儲存在適當?shù)臈l件下（如-20°C或-80°C），并避免反復凍融，以保持酶的活性。
注意事項
·整個前處理過程中應(yīng)避免酶的非特異性吸附和失活，使用無菌操作，避免微生物污染。
·根據(jù)酶的特性，可能需要在特定的條件下進行處理，如某些酶可能需要在無氧環(huán)境下處理，以防止氧化。
·樣品前處理的每一步驟都應(yīng)詳細記錄，包括使用的試劑、條件和結(jié)果，以便于實驗的復現(xiàn)和結(jié)果的解釋。
漢廣提供“一站式”檢測服務(wù)，您只需要提供樣本原樣，漢廣會嚴格按照國標或行標，進行樣本前處理、指標檢測，數(shù)據(jù)統(tǒng)計、報告編寫等工作，減少科研工作者的工作量。
取樣前，請與業(yè)務(wù)經(jīng)理溝通您的檢測需求，確認樣品類型以及寄樣方式，以免影響檢測數(shù)據(jù)的真實性，造成時間及成本的損失！
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